牛病毒性腹瀉檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：牛病毒性腹瀉檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Bovine Viral Diarrhea Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測牛病毒性腹瀉病毒，對牛病毒性腹瀉病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對牛病毒性腹瀉病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含牛病毒性腹瀉病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | BVDV RT-PCR反應(yīng)液 | 437.5μL×1管 | 875 μL×1管 |
2 | BVDV 混合酶液 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
3 | BVDV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | BVDV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為牛病毒性腹瀉靶基因的質(zhì)粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.取咽喉拭子和鼻拭子，采集方法如下：
(1) 咽喉拭子，采取時要將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液；
(2) 鼻拭子，將拭子深入鼻腔及周圍圈沾取分泌液；
(3) 將咽喉拭子和鼻拭子一起放入有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用；
（4）理想情況下標本應(yīng)使用頭部為合成纖維的拭子，用鋁或塑料做桿。不推薦棉拭子和木桿。
2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.標本采集管應(yīng)包含含有蛋白穩(wěn)定劑的病毒運輸液。
4.應(yīng)避免標本間交叉污染。
5.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表 | RT-PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶 | 2.5 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 BVDV 熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 50℃：10分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陽性（＋） | 標本中檢測出BVDV RNA |
陰性（－） | 標本中未檢出BVDV RNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為103 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。
